एजिंग सेल-गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग किट

अधिकांश सामान्य कोशिकाओं की विभाजन क्षमता सीमित होती है। जब वे विभाजित नहीं हो पाते, तो वे जीर्णता की स्थिति में प्रवेश कर जाते हैं, जिसे कोशिका जीर्णता कहा जाता है। सेल सेनेसेंस एक सेल के लिए उसकी विकास क्षमता को नियंत्रित करने की गारंटी तंत्र है, जिसका आम तौर पर मतलब प्रतिकृति सेनेसेंस होता है। सामान्य कोशिकाएँ सीमित संख्या में विभाजन के बाद विभाजित होना बंद कर देती हैं और अपरिवर्तनीय वृद्धि रुक ​​जाती है। इस समय, कोशिकाएं अभी भी जीवित हैं, लेकिन कोशिका आकृति विज्ञान और शारीरिक चयापचय गतिविधि में महत्वपूर्ण परिवर्तन होते हैं, जो आमतौर पर बड़ी कोशिका मात्रा और उम्र बढ़ने के साथ जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ के सक्रियण द्वारा दर्शाए जाते हैं। -गैलेक्टोसिडेज़ कोशिका लाइसोसोम में एक हाइड्रोलाइटिक एंजाइम है। यह आमतौर पर pH 4.0 पर सक्रिय होता है, लेकिन वृद्ध कोशिकाओं में यह pH 6.{5}} पर सक्रिय होता है। यह किट उम्र बढ़ने के साथ जुड़े -गैलेक्टोसिडेज़ गतिविधि स्तर के अप-विनियमन के खिलाफ उम्र बढ़ने वाले ऊतकों या कोशिकाओं को दागने की इस घटना और सिद्धांत पर आधारित है। विशिष्ट प्रतिक्रिया सिद्धांत यह है कि एक्स-गैल को सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाता है, और सेन्सेंट सेल विशिष्ट -गैलेक्टोसिडेज़ नीले उत्पाद उत्पन्न करने के लिए सब्सट्रेट को उत्प्रेरित करता है, जिसे कोशिका के साइटोप्लाज्म में नीले तलछट द्वारा दर्शाया जाता है, जिसे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है। . गणना के अनुसार कि प्रत्येक नमूने के लिए धुंधला घोल की मात्रा 1 एमएल है, किट 100 नमूनों का धुंधलापन पूरा कर सकती है।

गीली बर्फ परिवहन; प्रकाश से 2-8 डिग्री दूर स्टोर करें, 12 महीने के लिए वैध। यदि एक्स-गैल पाउडर का घोल तैयार किया जाता है, तो इसे छोटे-छोटे भागों में विभाजित किया जाता है और -20 डिग्री पर संग्रहित किया जाता है, जो 3 महीने के भीतर प्रभावी होता है।

अभिकर्मकों की तैयारी

1. अपना खुद का पीबीएस बफर तैयार करें (G4202 अनुशंसित).

2. 1 0 0 मिलीग्राम एक्स-गैल पाउडर को पूरी तरह से भंग कर दिया गया और 5 एमएल डीएमएफ (डाइमिथाइलफॉर्मामाइड) के साथ मिलाया गया, और फिर 1.5 एमएल स्वच्छ सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित किया गया, प्रत्येक ट्यूब के लिए 0.5 एमएल, और {{8} पर संग्रहीत किया गया } प्रकाश से डिग्री दूर। बार-बार जमने और पिघलने से बचें।

3. नीचे दी गई तालिका में अनुपात के अनुसार -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग समाधान तैयार करना। {{2}वेल प्लेटों में संवर्धित कोशिकाओं के लिए, 1.0-1.5 एमएल स्टेनिंग वर्किंग सॉल्यूशन प्रति कुएं की आवश्यकता होती है, और {{6}वेल प्लेटों के लिए, 0।{{8 }}.0 एमएल स्टेनिंग वर्किंग सॉल्यूशन की आवश्यकता प्रति कुएं पर होती है। बर्बादी से बचने के लिए नमूना आकार के अनुसार धुंधला घोल तैयार किया गया था।

1. अनुयाई कोशिकाओं के लिए

(1) अच्छी तरह से प्लेटों में संवर्धित कोशिकाओं (या सेल क्रॉलिंग शीट) को एस्पिरेट किया गया और सेल कल्चर माध्यम को हटा दिया गया, पीबीएस के साथ दो बार धोया गया, और 1 एमएल -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग फिक्सिंग समाधान जोड़ा गया, और कोशिकाओं को हटा दिया गया। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए रखें।

(2) स्थिर घोल को त्याग दिया गया, और कोशिकाओं को पीबीएस से 3 बार, हर बार 2 मिनट तक धोया गया।

(3) पीबीएस को एक पिपेट के साथ सक्शन द्वारा हटा दिया गया था, और 1 एमएल -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग वर्किंग सॉल्यूशन को प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था और 2 घंटे से लेकर रात भर के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया था। नोट: कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री पर इनक्यूबेट न करें। धुंधला होने की अवधि के दौरान, रंग विकास को समय पर देखा जाना चाहिए। यदि नमूने में -गैलेक्टोसिडेज़ की अभिव्यक्ति अधिक है, तो धुंधलापन कुछ घंटों के भीतर पूरा किया जा सकता है। यदि -गैलेक्टोसिडेज़ की अभिव्यक्ति कम थी, तो ऊष्मायन समय उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए, जिसके दौरान तरल वाष्पीकरण को धुंधला परिणामों को प्रभावित करने से रोकने के लिए अच्छी तरह से प्लेट को प्लास्टिक रैप या पैराफिल्म से सील किया जाना चाहिए।

(4) साधारण प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के तहत, सकारात्मक कोशिकाओं के रंग विकसित होने के बाद धुंधला घोल हटा दिया गया। यदि नाभिक को प्रतिदागित करने की आवश्यकता है, तो थोड़ी मात्रा में न्यूक्लियर फास्ट रेड घोल मिलाएं (G1035 की अनुशंसा की जाती है) 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं और दाग को कवर करने के लिए अच्छी तरह से प्लेट में, दाग समाधान हटा दें, और पीबीएस के साथ कई बार धोएं।

(5) कोशिकाओं को ढकने के लिए 2 एमएल पीबीएस जोड़ा गया और धुंधलापन पूरा हो गया। सैंपल को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री पर स्टोर किया जा सकता है। या कोशिकाओं को ढकने के लिए 70% ग्लिसरॉल मिलाएं, 4 डिग्री को लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि यह सेल क्लाइंबिंग शीट है, तो क्लाइंबिंग शीट को पूरी तरह से सुखाया जा सकता है, तटस्थ गम सील शीट को गिराने के बाद जाइलीन पारदर्शी, लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है।

2. जमे हुए वर्गों के लिए

(1) 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जमे हुए हिस्सों को दोबारा गर्म करें। ऊतक स्ट्रोक के साथ ऊतक को घेरें।

(2) ऊतक को पूरी तरह से ढकने के लिए ऊतक में उचित मात्रा में -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग फिक्सिंग घोल मिलाया गया और घोल को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए रखा गया।

(3) ऊतक वर्गों को पीबीएस में 3 बार, 5 मिनट तक भिगोया और धोया गया।

(4) प्रकाश से बचने के लिए वर्गों को एक गीले बॉक्स में रखा गया था, और ऊतक को पूरी तरह से कवर करने के लिए ऊतक में उचित मात्रा में -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग समाधान जोड़ा गया था। गीले बॉक्स को 37 डिग्री पर इनक्यूबेट किया गया और हर 2 घंटे में माइक्रोस्कोप के नीचे रंग विकास देखा गया। यदि कोई रंग विकास नहीं देखा गया, तो संस्कृति तब तक जारी रखी गई जब तक कि ऊतक पर पुरानी कोशिकाओं ने रंग नहीं दिखाया। यदि नमूने को रात भर इनक्यूबेट किया जाना है, तो धुंधला घोल को वाष्पित होने और गोलियों को सूखने से रोकने के लिए पर्याप्त मात्रा में -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग घोल मिलाया जाना चाहिए।

(5) ऊतक का रंग विकसित होने के बाद, दाग का घोल हटा दिया गया, और वर्गों को पीबीएस में डुबोया गया और दो बार धोया गया, और फिर शुद्ध पानी में डुबोया गया और दो बार धोया गया।

(6) (वैकल्पिक) न्यूक्लियर फास्ट रेड घोल जोड़ें (G1035 की अनुशंसा की जाती है) 3 मिनट के लिए और 3 बार धो लें।

(7) वर्गों को 2 बार पूर्ण इथेनॉल के साथ निर्जलित किया गया, फिर हर बार 5 मिनट के लिए जाइलीन के साथ पारदर्शी किया गया, और फिर तटस्थ गम ड्रॉप के साथ सील कर दिया गया।

3. धुंधलापन परिणाम

वृद्ध कोशिकाओं का कोशिकाद्रव्य नीला बिखरा हुआ होता है।

1. उपयोग से पहले एक्स-गैल घोल को कमरे के तापमान पर पूरी तरह से पिघलाया और मिलाया जाना चाहिए।

2. -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग सॉल्यूशन ए और बी को उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर बहाल किया जाना चाहिए, और तैयार स्टेनिंग सॉल्यूशन को उपयोग से पहले बिना वर्षा के अच्छी तरह मिलाया जाना चाहिए।

3. सेन्सेंट कोशिकाओं की -गैलेक्टोसिडेज़ स्टेनिंग प्रतिक्रिया विशिष्ट pH स्थितियों पर निर्भर होती है, इसलिए इसे CO में इनक्यूबेट नहीं किया जा सकता है₂रंग विकास के लिए इनक्यूबेटर, अन्यथा यह धुंधला घोल के पीएच को प्रभावित करेगा और दाग फेल हो जाएगा।

4. रंगाई समाधान तैयार करते समय, कृपया पॉलीस्टाइनिन (पीएस) के बजाय पॉलीप्रोपाइलीन (पीपी) या ग्लास से बने उपभोग्य सामग्रियों का चयन करें।

5. 2 घंटे-रात की रंग विकास अवधि के दौरान रंग विकास को कई बार देखा जाना चाहिए, बहुत कम समय नकारात्मक परिणाम दे सकता है; बहुत अधिक समय झूठी सकारात्मकता को जन्म दे सकता है। क्रोमोजेनिक समय नमूने में निहित -गैलेक्टोसिडेज़ की मात्रा से निकटता से संबंधित है।

6. स्टेनिंग सॉल्यूशन तैयार करने से पहले, स्टेनिंग सॉल्यूशन ए के पीएच मान की जांच करें। यदि यह 6 नहीं है। } उपयोग से पहले HCl या NaOH के साथ।

7. - ऊतक वर्गों के गैलेक्टोसिडेज़ धुंधलापन के लिए नमूनों की उच्च तैयारी की आवश्यकता होती है, जिसे -80 डिग्री पर संग्रहित किया जाना चाहिए और जल्द से जल्द परीक्षण किया जाना चाहिए। क्योंकि -गैलेक्टोसिडेज़ को निष्क्रिय करना बहुत आसान है, अनुचित भंडारण या नमूने के बहुत लंबे समय तक रहने से एंजाइम निष्क्रिय हो सकता है, फिर कोई सकारात्मक धुंधलापन नहीं आएगा।

8. कृपया ऑपरेशन के दौरान लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें

इमेजिस:

चित्र.1WI-38 कोशिकाओं को -गैलेक्टोसिडेज़ किट से रंगा गया था। बाईं तस्वीर में बिना विभाजन और प्रसार क्षमता के लेकिन फिर भी जीवित रहने वाली वृद्धावस्था WI{3}} कोशिकाओं को दिखाया गया है। धुंधला होने के बाद, सकारात्मक धुंधला कोशिकाएं 95% से अधिक थीं। दाहिनी ओर की छवि 3 से कम मार्ग वाली नव पुनर्जीवित WI{5}} कोशिकाओं (प्रारंभिक मार्ग) को दिखाती है, और धुंधला होने के बाद कोई स्पष्ट सकारात्मक कोशिका नहीं है।

केवल अनुसंधान उपयोग के लिए!

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