बीसीए प्रोटीन मात्रात्मक जांच किट

प्रोटीन सांद्रता के मात्रात्मक निर्धारण के लिए ब्रैडफोर्ड और बीसीए विधियाँ सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधियाँ हैं। बीसीए प्रोटीन क्वांटिटेटिव डिटेक्शन किट एक डिटर्जेंट-संगत फॉर्मूलेशन है जो कुल प्रोटीन के वर्णमिति पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए बाइसीनकोनिक एसिड (बीसीए) पर आधारित है। यह विधि एक क्षारीय माध्यम (बाइयूरेट प्रतिक्रिया) में प्रोटीन द्वारा Cu{2}} से Cu+ की सुविख्यात कमी को बाइसीनकोनिक एसिड युक्त एक अद्वितीय अभिकर्मक का उपयोग करके क्यूप्रस धनायन (Cu+) के अत्यधिक संवेदनशील और चयनात्मक वर्णमिति पता लगाने के साथ जोड़ती है। . इस परख का बैंगनी रंग का प्रतिक्रिया उत्पाद एक क्यूप्रस आयन के साथ बीसीए के दो अणुओं के केलेशन द्वारा बनता है। यह पानी में घुलनशील कॉम्प्लेक्स 562 एनएम पर एक मजबूत अवशोषण प्रदर्शित करता है जो एक व्यापक कार्य सीमा (50-2000 µg/mL) पर प्रोटीन सांद्रता बढ़ाने के साथ लगभग रैखिक है।

यह विधि अधिकांश नमूनों में रासायनिक पदार्थों और डिटर्जेंट की उच्च सांद्रता से प्रभावित नहीं होती है, जिसमें 5% एसडीएस, 5% ट्राइटन एक्स -100 और 5% ट्विन -20, 60, 80, आदि शामिल हैं। हालांकि, चेलेटिंग एजेंट और उच्च सांद्रता कम करने वाला एजेंट पता लगाने के परिणामों को प्रभावित करेगा। इसलिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि नमूने में कोई ईजीटीए नहीं है, ईडीटीए की सांद्रता 10 एमएम से कम है, और डीटीटी और -मर्कैप्टोएथेनॉल की सांद्रता 1 एमएम से कम है। यदि नमूने में चेलेटिंग एजेंट या कम करने वाला एजेंट है, तो कृपया ब्रैडफोर्ड प्रोटीन मात्रात्मक पहचान किट (जी2001) पर विचार करें।

कमरे के तापमान पर जहाज; प्रोटीन मानक (बीएसए) स्टोर 2-8 डिग्री पर, 12 महीने के लिए वैध। प्रोटीन मानक घोल को -20 डिग्री पर संग्रहित किया जाना चाहिए और 6 महीने के भीतर उपयोग किया जाना चाहिए। शेष अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जाता है, जो 12 महीने के लिए वैध होता है।

1. प्रोटीन मानक भंडारण समाधान की तैयारी: प्रोटीन मानक ट्यूब (बीएसए) में 1 एमएल प्रोटीन मानक पतला समाधान जोड़ें, और 25 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के साथ प्रोटीन मानक भंडारण समाधान प्राप्त करने के लिए 25 मिलीग्राम प्रोटीन मानक को पूरी तरह से भंग कर दिया जाता है। मानक प्रोटीन भंडारण समाधान को -20 डिग्री पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है;

2. प्रोटीन मानक कार्यशील समाधान तैयार करना: 0.5 मिलीग्राम/मिलीलीटर की अंतिम सांद्रता के साथ प्रोटीन मानक कार्यशील समाधान प्राप्त करने के लिए 25 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन मानक भंडारण समाधान को पीबीएस या सामान्य खारा के साथ 5 0 बार पतला किया जाता है। सटीकता सुनिश्चित करने के लिए तनुकरण के लिए 10 गुना ग्रेडिएंट विधि पर ध्यान दें।

3. मानक वक्र (माइक्रोप्लेट प्रक्रिया): प्रोटीन मानक कार्यशील समाधान को {{1}वेल प्लेट में 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 और 2{18}} पर जोड़ा गया था। μL, और फिर उपरोक्त ग्रेडिएंट वर्किंग सॉल्यूशन को 20, 19, 18, 16, 12, जोड़कर 20 μL में पुनः भर दिया गया। निम्नलिखित क्रम में 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 और 500 ug/mL पर प्रोटीन की सांद्रता के साथ ग्रेडिएंट वक्र प्राप्त करने के लिए पीबीएस या फिजियोलॉजिकल सेलाइन के साथ 8, 4 और 0 μL। ग्रेडिएंट वक्र 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ug/mL के क्रम में प्राप्त किए गए थे।

4. परीक्षण-नमूना तैयार करना: परीक्षण-नमूना उचित रूप से पतला किया जाता है (पूर्व-परीक्षण पता लगाने के माध्यम से, परीक्षण-नमूने की प्रोटीन सांद्रता मानक वक्र की सीमा के भीतर होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पता लगाने के परिणाम विश्वसनीय हैं), और प्रत्येक परीक्षण-नमूने के 20 µL को अच्छी प्लेटों में पिपेट करें। परीक्षण-नमूना और प्रोटीन मानक कार्यशील घोल को एक ही घोल से पतला किया जाता है।

5. बीसीए कार्यशील घोल तैयार करना: बीसीए अभिकर्मक के 50 भागों को कॉपर सल्फेट घोल के 1 भाग (50:1, बीसीए अभिकर्मक: कॉपर सल्फेट घोल) के साथ मिलाना। बीसीए कार्यशील समाधान को कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है और 24 घंटों के भीतर उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक कुएं में बीसीए कार्यशील समाधान का 200 μL जोड़ें। बर्बादी से बचने के लिए आवश्यकतानुसार तैयारी करने की अनुशंसा की जाती है।

6. पता लगाना: प्रत्येक कुएं में 2{5}}0 μL बीसीए कार्यशील घोल डालें और 30 सेकंड के लिए प्लेट शेकर पर प्लेट को अच्छी तरह मिलाएं; प्लेट को कवर करने और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट करने के बाद, मानक वक्र संख्या 0 का उपयोग प्लेट रीडर पर 562 एनएम पर या उसके करीब अवशोषण को मापने के लिए एक संदर्भ के रूप में किया गया था। (ध्यान दें: इसे कमरे के तापमान पर 2 घंटे या 60 डिग्री पर 30 मिनट तक भी प्रतिक्रिया दी जा सकती है। यदि प्रोटीन सांद्रता कम है, तो इसे 60 डिग्री पर प्रतिक्रिया करने की सलाह दी जाती है)

7. गणना: मानक वक्र ग्रेडिएंट प्रोटीन सामग्री (यूजी/एमएल) को एब्सिस्सा और अवशोषण मान को कोटि के रूप में लेकर तैयार किया गया था। परीक्षण-नमूने के अवशोषण मूल्य के अनुसार, संबंधित कुएं में परीक्षण-नमूने की प्रोटीन सांद्रता (यूजी/एमएल) मानक वक्र पर पाई जा सकती है, और फिर नमूने के कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करके वास्तविक प्रोटीन प्राप्त किया जा सकता है। परीक्षण-नमूने की एकाग्रता.

1. बीसीए विधि द्वारा प्रोटीन सांद्रता का निर्धारण तापमान और समय से बहुत प्रभावित होता है, और समय के विस्तार या तापमान में वृद्धि के साथ अवशोषण मूल्य बदल जाएगा। यदि रंग प्रतिक्रिया का समय और तापमान सटीक रूप से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, तो प्रत्येक निर्धारण के लिए एक मानक वक्र बनाने की सिफारिश की जाती है।

2. प्रोटीन मानक भंडारण समाधान तैयार करते समय, पर्याप्त विघटन सुनिश्चित करना आवश्यक है। प्रोटीन मानक कार्यशील घोल तैयार करते समय 10 गुना धीरे-धीरे पतला करने की सिफारिश की जाती है। त्रुटि से बचने के लिए एक बार में 50 बार पतला न करें।

3. प्रोटीन की मात्रा की गारंटी के लिए, समान पहचान स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए नमूना निष्कर्षण और प्रोटीन मानक कमजोर पड़ने के लिए एक ही बफर समाधान चुनना बेहतर है। यदि बफ़र का पृष्ठभूमि मान उच्च है, तो अन्य विधियों की अनुशंसा की जाती है।

4. अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, कृपया सुरक्षा चश्मा, दस्ताने या सुरक्षात्मक कपड़े पहनें।

केवल अनुसंधान उपयोग के लिए!

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