क्लिक-आईटी एडयू-555 सेल प्रसार परख किट

 

प्रोडक्ट का नाम	उत्पाद की पहचान	नमूना
क्लिक-आईटी एडयू-555 सेल प्रसार परख किट	G1602	100T

 

 

कोशिका प्रसार क्षमता का विश्लेषण जीवन विज्ञान में एक सामान्य और महत्वपूर्ण मूल्यांकन पद्धति है। यह इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं पर कुछ जीनों, दवाओं आदि के प्रभाव का न्याय कर सकता है, या विभिन्न परिस्थितियों या उत्तेजना के तहत ऊतक कोशिकाओं की वृद्धि और नवीकरण क्षमता का विश्लेषण कर सकता है। वर्तमान में, कोशिका प्रसार का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं। उनमें से अधिकांश अप्रत्यक्ष रूप से कोशिका प्रसार गतिविधि (जैसे सीसीके -8 विधि, एमटीटी विधि, आदि) का आकलन करने के लिए कोशिकाओं द्वारा उत्पादित कुछ चयापचय एंजाइमों का उपयोग करते हैं, लेकिन कुछ दवाएं या कोशिका की स्थिति पर एक निश्चित प्रभाव पड़ेगा मूल्यांकन के परिणाम. कोशिका प्रसार का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं में डीएनए संश्लेषण का प्रत्यक्ष पता लगाना सबसे सटीक और प्रभावी पता लगाने की विधि के रूप में पहचाना जाता है। हालाँकि, मूल रेडियोलेबल न्यूक्लियोसाइड निगमन विधि और एंटीबॉडी का पता लगाने के आधार पर BrdU विधि के बाद के सुधार दोनों की अपनी-अपनी सीमाएँ हैं।

EdU (5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन, 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन) एक थाइमिडीन एनालॉग है जिसमें एसिटिलीन समूह होता है, जब इसे जानवरों में इंजेक्ट किया जाता है या संवर्धित कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया जाता है। इन विट्रो, ये छोटे अणु तेजी से विभिन्न अंगों और ऊतकों में फैल सकते हैं, और कोशिकाओं में घुसपैठ कर सकते हैं, और कोशिका के दौरान नए संश्लेषित डीएनए में थाइमिडीन (टी) को प्रतिस्थापित कर सकते हैं। प्रसार. EdU अणु में एसिटिलीन समूह कॉपर आयनों के उत्प्रेरण के तहत एक स्थिर ट्राईज़ोल रिंग बनाने के लिए फ्लोरोसेंटली iF488 लेबल वाले एज़ाइड यौगिक जांच के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है, इसलिए नए संश्लेषित डीएनए को संबंधित फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल किया जा सकता है। रेडियोलेबल्ड न्यूक्लियोसाइड निगमन विधि की तुलना में, एडयू डिटेक्शन विधि में रेडियोधर्मी संदूषण जैसे कोई सीमित कारक नहीं हैं; BrdU डिटेक्शन विधि की तुलना में, EdU डिटेक्शन विधि में डीएनए विकृतीकरण या एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की आवश्यकता नहीं होती है, जो प्रयोग की जटिलता को काफी कम कर देता है और प्रयोग को अधिक समय बचाने वाला, अधिक संवेदनशील, अधिक स्थिर और अधिक सटीक बनाता है।

इस किट का उपयोग संवर्धित कोशिकाओं या जानवरों के ऊतकों में कोशिका प्रसार का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इस किट में फ्लोरोसेंट जांच लाल प्रतिदीप्ति है, अधिकतम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 557 एनएम है, और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 570 एनएम है। प्रसार करने वाली कोशिकाओं को लेबल करने के बाद, कोशिका नाभिक चमकदार लाल प्रतिदीप्ति दिखाएगा, और कोशिका नाभिक को मिलान पारंपरिक परमाणु डाई के साथ संयुक्त रूप से लेबल किया जाएगा (यह किट होचस्ट 33342 सेल परमाणु डाई प्रदान करता है), आप प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सकते हैं और कोशिका प्रसार का सीधे निरीक्षण करने के लिए अन्य उपकरण; आप इन विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का भी उपयोग कर सकते हैं, और फिर मध्य-एस चरण में प्रतिदीप्ति तीव्रता डीएनए प्रतिकृति गतिविधि के आधार पर कोशिका चक्र निर्धारित कर सकते हैं।

 

 

गीली बर्फ द्वारा परिवहन; एडयू उत्प्रेरक अभिकर्मक (अभिकर्मक ए) और प्रतिक्रिया बफर को 4 डिग्री पर संग्रहीत किया जा सकता है, जो 12 महीने के लिए वैध है।

 

 

घटक संख्या	अवयव	G1602-100T
G1602-1	एडयू भंडारण समाधान (10 एमएम)	100 μL
G1602-2	उत्प्रेरक अभिकर्मक (अभिकर्मक ए)	120 μL
G1602-3	फ्लोरोसेंट डाई iF555 (अभिकर्मक बी)	50 μL
G1602-4	उत्प्रेरक योज्य (अभिकर्मक सी)	2×100 मिलीग्राम(पाउडर)
G1602-5	प्रतिक्रिया बफ़र	20 एमएल
G1602-6	होचस्ट 33342 धुंधला समाधान	30 μL
नियमावली		कॉपी पर

 

 

1. सीरम युक्त कोशिका संवर्धन माध्यम;

2. पारगम्यीकरण अभिकर्मक:0.2%- 0.5% ट्राइटन® एक्स-100 पीबीएस में (जी1204);

3. फिक्सेटिव: 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड (जी1101) या अन्य समान अभिकर्मक;

4. फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस);

5. अतिशुद्ध जल;

6. पशु मॉडलिंग और ऊतक अनुभाग संबंधित अभिकर्मक (पशु ऊतक कोशिका प्रसार का पता लगाना)

 

 

1. इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं का पूर्व उपचार:

1.1. कोशिकाओं को एक निश्चित घनत्व पर सेल कल्चर प्लेट में समान रूप से रोपित करें (रोपण घनत्व कोशिका आकार, विकास गति आदि जैसे कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है)। कोशिकाओं के दीवार से चिपक जाने या सामान्य अवस्था में लौटने के बाद, संबंधित दवा उत्तेजना और अन्य उपचार करें। (निलंबन कोशिकाओं के लिए, कृपया निलंबन कोशिकाओं की सामान्य संचालन विधि का पालन करें। पूरे प्रयोग में सेंट्रीफ्यूजेशन और अन्य चरणों को जोड़ने की आवश्यकता है)।

1.2. कैटेलिटिक एडिटिव (अभिकर्मक सी) को कम गति पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, 100 मिलीग्राम लिया गया और 1 एमएल अल्ट्राप्योर पानी मिलाकर घोल दिया गया और वितरित किया गया और -20 डिग्री पर संग्रहीत किया गया, शेष पाउडर को रिजर्व के रूप में रखा गया था।

2. इन विट्रो सेलुलर एडयू लेबलिंग, निर्धारण और पारगम्यीकरण:

2.1. 2×EdU इनक्यूबेशन वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें: संपूर्ण सेल कल्चर माध्यम के प्रत्येक 1 एमएल में 2 μL EdU स्टोरेज सॉल्यूशन (10 mM) जोड़ें, जो कि 20 μM 2×EdU इनक्यूबेशन वर्किंग सॉल्यूशन है, और इसे पहले से गरम करने के लिए इनक्यूबेटर में डालें (अनुशंसित) प्रारंभिक प्रयोगों के लिए EdU कार्य एकाग्रता 10 μM है);

2.2. आधे-बदलते मोड में, कल्चर प्लेट में मूल सेल कल्चर माध्यम के आधे हिस्से को एस्पिरेट करें, और पहले से गरम 2×EdU इनक्यूबेशन वर्किंग सॉल्यूशन की समान मात्रा डालें, और एक निश्चित अवधि के लिए इनक्यूबेट करें (इन्क्यूबेशन की अवधि आम तौर पर निर्भर करती है) संबंधित कोशिकाओं के विकास चक्र पर, जो आमतौर पर कोशिका चक्र का लगभग 10% होता है, ज्यादातर अनुवर्ती और तेजी से बढ़ने वाली कोशिकाओं के लिए, विशिष्ट मामलों के लिए लगभग 2 घंटे तक ऊष्मायन की सिफारिश की जाती है सेल विशेषताओं, उपचार के बाद की वास्तविक स्थिति आदि के साथ समायोजित। यदि लंबे समय तक ऊष्मायन समय की आवश्यकता होती है, तो एडयू कार्यशील एकाग्रता को कम समय के लिए उचित रूप से कम किया जा सकता है, एडयू एकाग्रता को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है);

2.3. एडयू इनक्यूबेशन के बाद, पीबीएस बफर के साथ 1-2 बार धोएं, कोशिकाओं को कवर करने के लिए फिक्सिंग तरल पदार्थ जोड़ें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठीक करें (यदि फ्लो साइटोमेट्री की आवश्यकता है, तो इस चरण से पहले अनुवर्ती कोशिकाओं को पचाया जाना चाहिए और फिर से निलंबित किया जाना चाहिए ठीक करें, निलंबन सेल प्रसंस्करण विधि का पालन करें); पीबीएस बफ़र के साथ 2-3 बार धोएं, हर बार 3-5 मिनट;

2.4. पीबीएस बफर निकालें, कोशिकाओं को कवर करने के लिए पारगम्यीकरण समाधान जोड़ें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं;

2.5. पारगम्यीकरण समाधान निकालें, पीबीएस बफर के साथ 1-2 बार धोएं, हर बार 3-5 मिनट। फिर चरण 4 पर जाएं.

3. पशु एडयू इंजेक्शन मॉडलिंग के साथ-साथ ऊतक अनुभाग प्रसंस्करण:

3.1. प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन, इंट्रामस्क्यूलर इंजेक्शन, चमड़े के नीचे इंजेक्शन, पूंछ नस इंजेक्शन इत्यादि द्वारा जानवरों को मॉडल करने के लिए एक या अधिक एडयू इंजेक्शन का उपयोग किया जाता है। आम तौर पर, पशु शरीर के वजन के लिए एडयू खुराक का अनुपात 5 मिलीग्राम/किलोग्राम होता है, वास्तविक इंजेक्शन की खुराक अनुसंधान सामग्री और पशु की स्थिति पर निर्भर करती है। इस किट में प्रदान किया गया EdU स्टोरेज समाधान मुख्य रूप से इन विट्रो सेल EdU लेबलिंग के लिए उपयोग किया जाता है। यदि आपको EdU के साथ किसी जानवर का मॉडल बनाने की आवश्यकता है, तो आप EdU अभिकर्मक को अलग से ऑर्डर कर सकते हैं (कैट नंबर: G5059);

3.2. छोटी आंत जैसी उपकला कोशिकाएं तेजी से बढ़ती हैं, जबकि मस्तिष्क कोशिकाएं धीरे-धीरे बढ़ती हैं। तेजी से बढ़ने वाले ऊतकों को लेबल करने में आमतौर पर 12 घंटे से कम समय लगता है, जबकि धीमी गति से बढ़ने वाले ऊतकों को लेबल करने में कई दिन लग सकते हैं। इष्टतम लेबलिंग समय विशिष्ट प्रयोग के अनुसार निर्धारित किया गया था। आंतों के उपकला ऊतक के तेजी से प्रसार के कारण, ऐसे ऊतक को लेबलिंग के लिए संदर्भ के रूप में अनुशंसित किया गया था।

3.3. निर्दिष्ट मानकों के अनुसार जानवर को मारने के बाद, आवश्यक ऊतकों को बाहर निकाला जाता है और पारंपरिक प्रक्रियाओं के अनुसार जमे हुए खंड या पैराफिन खंड बनाए जाते हैं:

एक। जमे हुए अनुभागों के लिए: अनुभागों को कमरे के तापमान पर लौटाएँ, उचित मात्रा में फिक्सिंग तरल पदार्थ डालें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें। फिक्सिंग तरल पदार्थ निकालें और पीबीएस बफर के साथ प्रत्येक को 3-5 मिनट के लिए 3 बार धोएं; पीबीएस बफर को हटा दें और ऊतक को उचित मात्रा में पारगम्यीकरण समाधान के साथ कवर करें और कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें; पारगम्यीकरण समाधान को हटा दें और पीबीएस बफर से 1- 2 बार, 3-5 मिनट तक हर बार धोएं। फिर चरण 4 पर जाएं.

बी। पैराफिन अनुभागों के लिए: अनुभागों को डीपराफिनाइज और पुनर्जलीकरण करें, और 5 मिनट के लिए पीबीएस से धोएं। पीबीएस बफर निकालें, कोशिकाओं या ऊतकों को कवर करने के लिए पारगम्यीकरण समाधान जोड़ें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं; फिर पीबीएस बफर से 1-2 बार धोएं, हर बार 3-5 मिनट तक। फिर चरण 4 पर जाएं.

4. EdU क्लिक प्रतिक्रिया:

4.1. कोशिका या ऊतक निर्धारण और वेध के दौरान, प्रतिक्रिया समाधान की तैयारी: निम्नलिखित अनुपात के अनुसार अभिकर्मकों को मिलाएं, नमूनों की संख्या के अनुपात में तैयारी की मात्रा बढ़ाई या घटाई जा सकती है।

 

अवयव	वॉल्यूम (सेल के लिए)	आयतन (हिस्टोलॉजिकल अनुभाग के लिए)
प्रतिक्रिया बफर	935 μL	928 μL
अभिकर्मक ए	10 μL	10 μL
अभिकर्मक बी (iF555 डाई)	5 μL	12 μL
अभिकर्मक सी	50 μL	50 μL
कुल क्षमता	1000 μL	1000 μL

 

4.2. कोशिकाओं या अनुभागों से पीबीएस बफर निकालें, प्रतिक्रिया समाधान जोड़ें, यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे से हिलाएं कि प्रतिक्रिया समाधान सभी कोशिकाओं या ऊतकों को कवर करता है, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं;

4.3. प्रतिक्रिया समाधान निकालें, पीबीएस बफर के साथ 2-3 बार धोएं, हर बार 3-5 मिनट (यदि कोई अन्य विशेष आवश्यकता नहीं है, तो प्रतिदीप्ति तीव्रता का पता फ्लो साइटोमेट्री द्वारा लगाया जा सकता है या प्रतिदीप्ति प्रभाव का पता लगाया जा सकता है) अन्य उपकरण)।

5. परमाणु दाग ​​(वैकल्पिक):

5.1. होचस्ट 33342 स्टेनिंग सॉल्यूशन को पीबीएस बफर के साथ 1:500-1000 के अनुपात में पतला करें, कोशिकाओं को कवर करने के लिए नमूने में जोड़ें, और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें;

5.2. होइचस्ट 33342 स्टेनिंग सॉल्यूशन निकालें, पीबीएस बफर से 2-3 बार धोएं, हर बार 3-5 मिनट।

6. इमेजिंग और पहचान विश्लेषण:

संसाधित कोशिकाओं या ऊतक अनुभाग नमूनों का पता लगाने और प्रसार करने वाली कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या कन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं को एकत्र किया जा सकता है और प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा जा सकता है (प्रवाह साइटोमेट्री परख के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में और उचित वोल्टेज चुनने के लिए एडयू के साथ लेबल नहीं किए गए सेल नमूनों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है), और आधारित प्रतिदीप्ति तीव्रता पर, कोशिका चक्र में एस-चरण की डीएनए प्रतिकृति गतिविधि निर्धारित की जा सकती है। इस किट में फ्लोरोसेंट डाई if555 (अभिकर्मक बी) Ex/Em के वर्णक्रमीय लक्षण वर्णन से मेल खाता है: 557 एनएम/570 एनएम (लाल); होचस्ट 33342 धुंधला समाधान Ex/Em के वर्णक्रमीय लक्षण वर्णन से मेल खाता है: 346 एनएम/460 एनएम (नीला)।

 

 

1. संवर्धित कोशिकाओं के लिए, विशिष्ट एडयू एकाग्रता और ऊष्मायन समय को नमूने और अनुसंधान उद्देश्य के आधार पर उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है।

2. कुछ ऊतक कोशिकाएं धीरे-धीरे बढ़ती हैं। खराब मॉडलिंग प्रभाव से बचने के लिए, तेजी से प्रसार वाले ऊतक के नमूनों को संदर्भ नमूने (जैसे आंतों के ऊतक) के रूप में चुनने की सिफारिश की जाती है।

3. यदि पृष्ठभूमि का रंग बहुत गहरा है, तो यह प्रयोग में अपर्याप्त धुलाई, लंबे समय तक फिक्सिंग और अवशिष्ट फिक्सेटिव आदि के कारण हो सकता है।

4. अभिकर्मक सी (ईडीयू उत्प्रेरक जोड़ अभिकर्मक) ऑक्सीकरण करना आसान है। लंबे समय तक हवा के संपर्क में रहने से बचने की कोशिश करें। जलीय घोल के रूप में तैयार होने के बाद, इसे एलिकोट में संग्रहित करने की अनुशंसा की जाती है; परीक्षण किया गया, जैसे कि EdU उत्प्रेरक योजक अभिकर्मक का रंग थोड़ा बदल जाता है, क्लिक प्रतिक्रिया उत्प्रेरक प्रणाली अभी भी सामान्य रूप से आगे बढ़ने में सक्षम है। यदि अभिकर्मक सी भूरा दिखाई देता है, तो यह इंगित करता है कि घटक समाप्त हो गया है, इसलिए कृपया इसे त्याग दें।

5. अपने स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए, कृपया ऑपरेशन के दौरान लैब कोट और दस्ताने पहनें।

 

केवल अनुसंधान उपयोग के लिए!

 

 

लोकप्रिय टैग: क्लिक-इट एडु-555 सेल प्रसार परख किट, चीन क्लिक-इट एडू-555 सेल प्रसार परख किट निर्माता, आपूर्तिकर्ता, कारखाना