एनेक्सिन वी-आईएफ488/पीआई सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट

 

प्रोडक्ट का नाम	बिल्ली। नहीं	विशेष.
एनेक्सिन वी-आईएफ488/पीआई सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट	G1513-50T	50 T
	G1513-100T	100 T

 

 

एपोप्टोसिस एक सामान्य शारीरिक प्रक्रिया है जो भ्रूण के विकास और ऊतक होमियोस्टैसिस के रखरखाव के दौरान होती है और कई रूपात्मक परिवर्तनों के साथ होती है, जिनमें से कोशिका झिल्ली का नुकसान एपोप्टोसिस की प्रारंभिक विशेषताओं में से एक है। सामान्य कोशिकाओं में, फॉस्फेटिडिलसेरिन (पीएस) केवल कोशिका झिल्ली के फॉस्फोलिपिड बाइलेयर के अंदरूनी हिस्से पर वितरित होता है। हालाँकि, एपोप्टोसिस के शुरुआती चरण में, पीएस लिपिड झिल्ली के अंदरूनी हिस्से से बाहरी तरफ पलट जाएगा, जिससे यह कोशिका के बाहर उजागर हो जाएगा। एनेक्सिन वी एक सीए है²⁺-पीएस के लिए उच्च आकर्षण वाला आश्रित फॉस्फोलिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन और यह विशेष रूप से पीएस के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं से जुड़ सकता है। इसलिए, कोशिकाओं के प्रारंभिक एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए एनेक्सिन वी का उपयोग संकेतकों में से एक के रूप में किया जाता है। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) एक न्यूक्लिक एसिड डाई है जो अक्षुण्ण कोशिका झिल्ली और प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं के साथ सामान्य कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता है, लेकिन यह देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं और दाग कोशिका नाभिक की कोशिका झिल्ली में प्रवेश कर सकता है।

यह उत्पाद कोशिकाओं के प्रारंभिक एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए एक जांच जांच के रूप में IF488 (उन्नत ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) और एनेक्सिन वी से बना एक संलयन प्रोटीन का उपयोग करता है। पीआई का उपयोग नेक्रोटिक और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए भी किया जाता है। एनेक्सिन वी-आईएफ488 और पीआई के संयोजन में, जीवित कोशिकाएं नकारात्मक धुंधलापन (एनेक्सिन वी-/पीआई-) दिखाती हैं, प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं एकल प्रतिदीप्ति सकारात्मक (एनेक्सिन वी+/पीआई-) दिखाती हैं, जबकि देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाएं दोहरी प्रतिदीप्ति सकारात्मक दिखाती हैं ( एनेक्सिन वी+/पीआई+)। यह किट फ्लो साइटोमेट्री या फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी डिटेक्शन के लिए उपयुक्त है। यह एपोप्टोटिक कोशिकाओं के मात्रात्मक पता लगाने के लिए भी उपयुक्त है क्योंकि IF488 एनेक्सिन वी के साथ 1:1 से जुड़ा हुआ है।

 

 

गीली बर्फ के साथ जहाज; प्रकाश से 2-8 डिग्री दूर स्टोर करें, 12 महीने के लिए वैध।

 

 

घटक संख्या	अवयव	G1513-50T	G1513-100T
G1513-1	एनेक्सिन वी-आईएफ488	250 μL	2×250 μL
G1513-2	प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई)	250 μL	2×250 μL
G1513-3	1×बाइंडिंग बफर	25 एमएल	2×25 एमएल
नियमावली		1 पीसी

 

 

1. कोशिकाओं का सस्पेंशन: सेल सस्पेंशन लें और 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 500xg पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।

2. अनुवर्ती कोशिकाएं: पहले सेल कल्चर सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें। फिर EDTA (अनुशंसित G4002 या G4011) के बिना ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को पचाएं, सेल कल्चर सुपरनेटेंट के साथ संयोजित करें और 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 500xg पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। अत्यधिक पाचन के कारण होने वाली झूठी सकारात्मकताओं से बचने के लिए ट्रिप्सिन पाचन बहुत लंबा नहीं होना चाहिए।

3. कोशिकाओं को प्री-कूल्ड पीबीएस (अनुशंसित G4202) से दो बार धोएं, और हर बार 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 500xg पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।

4. प्री-कूल्ड 1×बाइंडिंग बफर के साथ कोशिकाओं को धीरे से पुनः निलंबित करें, और सेल एकाग्रता को 1~5×10 पर समायोजित करें⁶/एमएल.

5. 100 μL सेल सस्पेंशन में 5 μLofAnnexin V-EGFP और 5 μLofPI जोड़ें, धीरे से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 8-10 मिनट के लिए प्रकाश से बचाएं।

6. प्री-कूल्ड 1×बाइंडिंग बफर का 400 μL जोड़ें, धीरे से हिलाएं, और 1 घंटे के भीतर पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

 

 

1. फ्लो साइटोमेट्री डिटेक्शन

ए) उचित वोल्टेज का चयन करें और प्रवाह साइटोमीटर विश्लेषण के लिए प्रकाश मुआवजे को समायोजित करें। प्रायोगिक समूह को छोड़कर वोल्टेज को समायोजित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (एनेक्सिन वी-आईएफ488 और पीआई लेबलिंग के बिना) और मुआवजे के समायोजन के लिए एकल मानक नियंत्रण (केवल एनेक्सिन वी-आईएफ488 और केवल पीआई वाले सेल) सेट करने की सिफारिश की जाती है। .

बी) फ्लो साइटोमेट्री का पता लगाने और विश्लेषण का संदर्भ उदाहरण: 6 घंटे के लिए 5 µM कैम्पटोथेसिन के साथ इंड्यूसजर्कैट टी लिंफोमा कोशिकाएं। उपरोक्त प्रायोगिक चरणों का संदर्भ लेते हुए, पता लगाने के लिए फ़्लो साइटोमेट्री का उपयोग करें। परिणाम निम्नलिखित चित्र में दिखाए गए हैं।

 

 

IF488 की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्घ्य 491 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य 518 एनएम है; पीआई-डीएनए कॉम्प्लेक्स की अधिकतम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 535 एनएम है और अधिकतम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 615 एनएम है। फ़्लो साइटोमेट्री सहसंबंध विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा दो-रंग का स्कैटर प्लॉट प्लॉट किया जाता है, जिसमें क्षैतिज समन्वय में IF488 और ऊर्ध्वाधर समन्वय में PI होता है। एक विशिष्ट प्रयोग में, जीवित कोशिकाएं गैर-फ्लोरोसेंट होती हैं और बिखराव बिंदु निचले बाएँ प्रथम चतुर्थांश में स्थित होता है। प्रारंभिक एपोप्टोसिस में कोशिकाओं में एक मजबूत हरे रंग की प्रतिदीप्ति होती है और बिखराव दूसरे निचले दाएं चतुर्थांश में होता है। अंतिम चरण की एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाएं दोहरी लाल और हरी प्रतिदीप्ति दिखाती हैं, जिसमें बिखराव बिंदु ऊपरी दाएं तीसरे चतुर्थांश में स्थित होता है।

 

2. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जांच

ए) स्लाइड में एनेक्सिन वी-आईएफ488 और पीआई डबल-स्टेन्ड सेल सस्पेंशन का 5-10 μL जोड़ें।

ख) कवरस्लिप से ढकें।

ग) प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के नीचे दो-रंग फिल्टर के साथ निरीक्षण करें। एनेक्सिन V-IF488 में हरा प्रतिदीप्ति संकेत है, और PI में लाल प्रतिदीप्ति संकेत है। (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ तस्वीरें लेते समय, प्रतिदीप्ति शमन समस्याओं को रोकने के लिए उचित मात्रा में एंटी-फ्लोरेसेंस शमन सीलर (जी1401) जोड़ने की सिफारिश की जाती है)

 

 

1. कोशिका विखंडन से बचने के लिए संपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रिया को यथासंभव धीरे से संभाला जाना चाहिए, जो प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है।

2. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोना छोड़ा नहीं जा सकता है, और अवशिष्ट पीबीएस को भी यथासंभव हटा दिया जाना चाहिए।

3. कोशिकाओं को पचाने के लिए ट्रिप्सिन का उपयोग करते समय, प्रयोग सावधानी से किया जाना चाहिए और कोशिकाओं को कृत्रिम क्षति से बचने के लिए पाचन समय को नियंत्रित किया जाना चाहिए। यदि पाचन का समय बहुत कम है, तो कोशिकाओं को गिरने के लिए जोर-जोर से पीटना पड़ता है, जिससे कोशिका झिल्ली को आसानी से यांत्रिक क्षति हो सकती है; यदि पाचन का समय बहुत लंबा है, तो कोशिका झिल्ली भी आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती है और परिणाम प्रभावित होंगे। इसके अलावा, EDTA युक्त ट्रिप्सिन का उपयोग नहीं किया जा सकता है। ईडीटीए एनेक्सिन वी से पीएस के बंधन को प्रभावित करेगा।

4. यदि एपोप्टोसिस उत्तेजना के बाद कुछ कोशिकाएं तैर रही हैं, तो अधिक सटीक परिणाम के लिए सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला और अनुवर्ती कोशिकाओं दोनों को दागने के लिए इकट्ठा करें।

5. एनेक्सिन वी-आईएफ488 और पीआई प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, कृपया ऑपरेशन के दौरान प्रकाश से बचें। प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद परीक्षण यथाशीघ्र किया जाना चाहिए।

6. अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, कृपया सुरक्षा चश्मा, दस्ताने या सुरक्षात्मक कपड़े पहनें।

 

केवल अनुसंधान उपयोग के लिए!

 

 

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