उत्पाद परिचय
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प्रोडक्ट का नाम |
बिल्ली.सं. |
विशेष. |
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पशु ऊतक एवं कोशिका आरएनए निष्कर्षण किट |
G3640-50T |
50T |
उत्पाद विवरण/परिचय
यह किट कॉलम विधि द्वारा जानवरों के ऊतकों और संवर्धित कोशिकाओं से आरएनए के शुद्धिकरण के लिए एक व्यापक स्पेक्ट्रम किट है। किट फिनोल, क्लोरोफॉर्म और अन्य कार्बनिक अभिकर्मकों के निष्कर्षण जैसे कार्बनिक अभिकर्मकों की आवश्यकता के बिना, और क्रमशः जीडीएनए इरेज़र स्पिन कॉलम (जीनोमिक डीएनए को हटाने) और आरएनए स्पिन कॉलम (आरएनए की बाइंडिंग) के माध्यम से एक विशेष लिसीस बफर सिस्टम को अपनाती है। , जानवरों के ऊतकों के 5-20 मिलीग्राम, उच्च शुद्धता वाले आरएनए की ताजी संवर्धित कोशिकाओं से शीघ्रता से निकाला जा सकता है, और पूरी प्रक्रिया केवल में ही पूरी की जा सकती है 30 मि. प्राप्त आरएनए का उपयोग विभिन्न आणविक जीव विज्ञान प्रयोगों जैसे उत्तरी ब्लॉटिंग, स्पॉट ब्लॉटिंग, एमआरएनए शुद्धि, इन विट्रो अनुवाद, आरएनएएस सुरक्षा परख, आरटी-पीसीआर, रियल टाइम आरटी-पीसीआर और सीडीएनए पुस्तकालयों के निर्माण में सीधे किया जा सकता है।
भंडारण और शिपिंग की शर्तें
प्रोटीनेज़ K, DNase और DTT सॉल्यूशन को गीली बर्फ के साथ भेजा जाना चाहिए, और -20 डिग्री पर संग्रहीत किया जाना चाहिए; अन्य अभिकर्मकों को 12 महीने तक कमरे के तापमान पर भेजा और संग्रहीत किया जाता है।
उत्पाद सामग्री
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घटक संख्या |
अवयव |
G3640-50T |
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G3640-1 |
बफ़र RL1 |
30 एमएल |
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G3640-2 |
बफर RW1 |
12 एमएल (उपयोग से पहले 18 एमएल निर्जल इथेनॉल मिलाएं) |
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G3640-3 |
बफर RW2 |
20 एमएल (उपयोग से पहले 80 एमएल निर्जल इथेनॉल जोड़ें) |
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G3640-4 |
डीटीटी समाधान |
1.2 एमएल |
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G3640-5 |
प्रोटीनेज के |
500 μL |
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G3640-6 |
DNase |
250 μL |
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G3640-7 |
10×DNase बफर |
500 μL |
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G3640-8 |
न्यूक्लियस मुक्त पानी |
12 एमएल |
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G3640-9 |
जीडीएनए इरेज़र स्पिन कॉलम |
50 सेट |
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G3640-10 |
आरएनए स्पिन कॉलम |
50 सेट |
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नियमावली |
कॉपी पर |
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उपयोग की तैयारी
1. यदि बफर आरएल1 में कोई अवक्षेप दिखाई देता है, तो अवक्षेप को घोलने के लिए इसे 37 डिग्री पर गर्म करें। इसे कमरे के तापमान तक ठंडा होने के बाद इस्तेमाल करें।
2. ऑपरेशन से पहले, 4% की अंतिम सांद्रता तक बफर आरएल1 में उचित मात्रा में डीटीटी सॉल्यूशन मिलाएं (बफर आरएल1 के प्रति 1 एमएल में 40 μL डीटीटी सॉल्यूशन मिलाएं। इसे उपयोग से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए। इस मिश्रण को 4 डिग्री पर संग्रहित किया जा सकता है। एक महीने के लिए।)
3. बफर RW1 और RW2 का उपयोग करने से पहले, कृपया जांच लें कि 100% इथेनॉल की निर्दिष्ट मात्रा जोड़ी गई है या नहीं।
4. निकाले जाने वाले नमूने की मात्रा के अनुसार 60% आइसोप्रोपेनॉल (उपयोग के लिए तैयार) पहले से तैयार करें, उदाहरण के लिए, 4 एमएल न्यूक्लिज़-मुक्त पानी (जी4700 अनुशंसित) से 6 एमएल आइसोप्रोपेनॉल।
5. यदि टिश्यू को ग्राइंडर से पीस रहे हैं तो कृपया ग्राइंडर को पहले से ठंडा कर लें।
विभिन्न नमूनों का आरंभिक जोड़ और बफ़र RL1 का उपयोग
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नमूना का प्रारंभिक जोड़ |
बफ़र RL1 का उपयोग |
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अनुवर्ती संवर्धित कोशिकाएँ (पेट्री डिश का व्यास <6 सेमी) |
350 µL |
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अनुवर्ती संवर्धित कोशिकाएँ (पेट्री डिश का व्यास 6~10 सेमी है) |
600 µL |
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सस्पेंशन संवर्धित कोशिकाएँ <5×106 |
350 µL |
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5×106~1×107 सस्पेंशन संवर्धित कोशिकाएँ |
600 µL |
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5~20 मिलीग्राम पशु ऊतक |
500 µL |
तालिका 1 विभिन्न नमूनों का प्रारंभिक जोड़ और बफ़र RL1 का उपयोग
परख प्रोटोकॉल/प्रक्रियाएँ
1. नमूने तैयार करना
एक। पशु ऊतक: ताजा या क्रायोप्रिजर्व्ड पशु ऊतक या आरएनएसॉलिड टिशू आरएनए स्टेबिलाइजेशन सॉल्यूशन (जी3019 की अनुशंसा) में संरक्षित पशु ऊतक को 1.5 एमएल न्यूक्लीज-मुक्त ट्यूब या {{5%) मिमी युक्त विशेष ग्राइंडिंग ट्यूब में स्थानांतरित करें। मोतियों को पीसना (जी0203-150जी की अनुशंसा करें) और 500 यूएल बफर आरएल1 (कृपया पुष्टि करें कि उपयोग से पहले डीटीटी जोड़ा गया है)। कम तापमान पर एक टिश्यू होमोजेनाइज़र (KZ{9}}F-3D अनुशंसित) का उपयोग करके ऊतक को समरूपीकरण के लिए अच्छी तरह से पीस लें (यदि ऊतक पूरी तरह से समरूप नहीं है, तो यह आरएनए की उपज और गुणवत्ता को प्रभावित करेगा) प्रोटीनेज़ K के 10 μL, अच्छी तरह मिलाएं, और फिर 56 डिग्री पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 12,{15}} आरपीएम पर 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। .
बी। आरएनएसॉलिड टिश्यू आरएनए स्टैबिलाइजेशन सॉल्यूशन (अनुशंसित G3019) में संरक्षित ताजा या क्रायोप्रिजर्व्ड पशु ऊतक या पशु ऊतक के 2-20 मिलीग्राम को 1.5 एमएल न्यूक्लिज-मुक्त ट्यूब या 500 यूएल बफर आरएल1 के साथ विशेष पीसने वाली ट्यूब में स्थानांतरित करें (कृपया पुष्टि करें कि डीटीटी समाधान उपयोग से पहले जोड़ा गया है)। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को बर्फ के स्नान में रखें और एक इलेक्ट्रिक ग्राइंडर का उपयोग करके ऊतक को पूरी तरह से पीसकर समरूप बना लें (यदि ऊतक पूरी तरह से समरूप नहीं है, तो यह आरएनए की उपज और गुणवत्ता को प्रभावित करेगा)। 10 μL प्रोटीनेज K मिलाएं, अच्छी तरह मिलाएं, और फिर 56 डिग्री पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 12,{11}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
सी। ताजा या क्रायोप्रिजर्व्ड पशु ऊतक या आरएनए सॉलिड टिशू आरएनए स्थिरीकरण समाधान (जी 3019 की सिफारिश करें) में संरक्षित पशु ऊतक को तरल नाइट्रोजन के साथ पहले से ठंडा किए गए मोर्टार में स्थानांतरित करें और एक मूसल के साथ ऊतक को पीसें, तरल नाइट्रोजन को लगातार जोड़ते रहें। पाउडर किया जाता है (यदि ऊतक पूरी तरह से समरूप नहीं है, तो यह आरएनए की उपज और गुणवत्ता को प्रभावित करेगा)। फिर पिसे हुए पाउडर के नमूने को 500 µL बफर आरएल1 युक्त 1.5 एमएल न्यूक्लीज़-मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें (कृपया पुष्टि करें कि उपयोग से पहले डीटीटी समाधान जोड़ा गया है) और बार-बार मिलाएं। 10 μL प्रोटीनेज K मिलाएं, अच्छी तरह मिलाएं, और फिर 56 डिग्री पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 12,{12}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
डी। सस्पेंशन कोशिकाएं: सस्पेंशन कल्चर कोशिकाओं को कल्चर माध्यम के साथ 1.5 एमएल न्यूक्लिज-मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 5 मिनट के लिए 1,{4}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, सस्पेंशन कल्चर कोशिकाओं को इकट्ठा करें (106-107), धीरे से एस्पिरेट करें और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, सेल अवक्षेप में बफर आरएल 1 (तालिका 1 में अनुशंसित जोड़) जोड़ें (कृपया पुष्टि करें कि उपयोग से पहले डीटीटी समाधान जोड़ा गया है), और पिपेट करें और समान रूप से तब तक फूंकें जब तक कोई स्पष्ट अवक्षेप नहीं है. फिर 10 μL प्रोटीनेज़ K डालें, अच्छी तरह से मिलाएं और 56 डिग्री पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, 12,{13}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री पर रखें।
ई. अनुवर्ती कोशिकाएँ: कोशिकाओं से विकास माध्यम निकालें और फिर 1×पीबीएस बफर (पीएच 7.4) से धोएं। संवर्धित कोशिकाओं में बफर आरएल1 (तालिका 1 में अनुशंसित जोड़) जोड़ें (कृपया पुष्टि करें कि उपयोग से पहले डीटीटी समाधान जोड़ा गया है), कोशिकाओं को पूरी तरह से गिराने के लिए पिपेट से धीरे से झटका दें, और कोशिकाओं से युक्त लाइसेट को 1.5 एमएल में स्थानांतरित करें न्यूक्लिज़-मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब। 10 μL प्रोटीनेज K मिलाएं, अच्छी तरह मिलाएं, और फिर 56 डिग्री पर 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और 4 डिग्री पर 5 मिनट के लिए 12,{12}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
2. पहले चरण से पशु ऊतक या सेल लाइसेट के सतह पर तैरनेवाला को एक जीडीएनए इरेज़र स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें (अवक्षेप की आकांक्षा से बचने के लिए) और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 12, {2}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
3. जीडीएनए इरेज़र स्पिन कॉलम को हटा दें, फ़िल्टर को कलेक्शन ट्यूब में रखें।
4. उपरोक्त चरण से संग्रह ट्यूब में प्रवाह के लिए 60% आइसोप्रोपेनॉल की समान मात्रा जोड़ें (इस बिंदु पर वर्षा हो सकती है)। एक तरल पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
5. सभी मिश्रण (अवक्षेप सहित) को आरएनए स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें, एक समय में 600 μL से अधिक न जोड़ें, या यदि 600 μL से अधिक हो तो बैचों में डालें।
6. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 12,{2}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें। अपशिष्ट तरल को त्यागें, और आरएनए स्पिन कॉलम को उसी संग्रह ट्यूब में पुनः डालें।
7. आरएनए स्पिन कॉलम में 500 μL बफर आरडब्ल्यू1 जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 12,{4}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और अपशिष्ट तरल को त्याग दें।
2. आरएनए स्पिन कॉलम में 600 μL बफर आरडब्ल्यू2 जोड़ें (पाइप दीवार पर बचे हुए नमक को फ्लश करने में मदद के लिए कृपया आरएनए स्पिन कॉलम पाइप दीवार के साथ बफर आरडब्ल्यू2 जोड़ें)। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 12,{5}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और अपशिष्ट तरल को त्याग दें।
8. (वैकल्पिक) डीएनएस पाचन: इस किट और जीडीएनए इरेज़र स्पिन कॉलम में मौजूद अभिकर्मक अधिकांश जीनोमिक डीएनए को प्रभावी ढंग से हटा देते हैं, और निकाले गए आरएनए में बहुत कम जीनोमिक डीएनए होता है। उच्च जीनोमिक डीएनए सामग्री वाले कुछ ऊतकों (जैसे, यकृत, गुर्दे, प्लीहा, आदि) के लिए या आरएनए शुद्धता के लिए अधिक कठोर आवश्यकताओं के साथ बाद के प्रयोगों के लिए, डीएनएस पाचन को आरएनए स्पिन कॉलम सोखना कॉलम झिल्ली पर चुनिंदा रूप से किया जा सकता है।
ए) DNase प्रतिक्रिया समाधान की तैयारी: 10× DNase बफर के 5 μL, DNase के 5 μL, और 40 μL न्यूक्लिज़-मुक्त पानी को एक नई 1.5 एमएल न्यूक्लिज़-मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मिलाया गया था।
बी) आरएनए स्पिन कॉलम के केंद्र में 50 μL DNase प्रतिक्रिया समाधान जोड़ें और इसे 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहने दें।
ग) आरएनए स्पिन कॉलम में 500 μL बफर आरडब्ल्यू2 जोड़ें, कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 12, {3}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, अपशिष्ट तरल को हटा दें, और कॉलम को संग्रह ट्यूब में वापस कर दें।
9. चरण 8 दोहराएँ.
10. आरएनए स्पिन कॉलम को एक कलेक्शन ट्यूब में रखें और बचे हुए तरल को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 12, {2}} आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
11. आरएनए स्पिन कॉलम को एक नई 1.5 एमएल न्यूक्लिज-मुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखा गया था और आरएनए स्पिन कॉलम में शेष इथेनॉल के पूर्ण वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट के लिए छोड़ दिया गया था।
11. आरएनए स्पिन कॉलम के केंद्र में μL न्यूक्लिज़-मुक्त पानी जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें। आरएनए को शांत करने के लिए कॉलम को कमरे के तापमान पर 12,{6}} आरपीएम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। आरएनए की उच्च सांद्रता प्राप्त करने के लिए, आप पहले एलुएट को आरएनए स्पिन कॉलम में भी जोड़ सकते हैं, इसे कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक खड़े रहने दें, 12 पर सेंट्रीफ्यूज करें, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और आरएनए को फिर से इकट्ठा करें।
टिप्पणी
1. कृपया उपयोग से पहले उत्पाद मैनुअल को ध्यान से पढ़ें।
2. जितना संभव हो ताजी संवर्धित कोशिकाओं या ऊतकों का उपयोग करने का प्रयास करें। यदि कोशिकाओं या ऊतकों को दीर्घकालिक संरक्षण की आवश्यकता होती है, तो आरएनए ठोस ऊतक आरएनए स्थिरीकरण समाधान (अनुशंसित बिल्ली संख्या: जी 3019) को तेजी से आरएनएएस निषेध और ऊतक नमूनों से आरएनए के स्थिर संरक्षण के लिए अनुशंसित किया जाता है।
3. अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, कृपया सुरक्षा चश्मा, दस्ताने या सुरक्षात्मक कपड़े पहनें। बोलने से बचें, क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए न्यूक्लिज़-मुक्त टिप्स, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करें।
4. इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण के साथ आरएनए निष्कर्षण के लिए एक विशेष ऑपरेटिंग बेंच का उपयोग किया जाना चाहिए।
अनुपूरक तालिका
इस किट द्वारा विभिन्न ऊतकों और कोशिकाओं से निकाले गए कुल आरएनए की मात्रा नीचे दी गई तालिका में दिखाई गई है। ऊतकों या कोशिकाओं से निकाली गई आरएनए उपज नमूनों की ताजगी या वृद्धि की स्थिति से संबंधित होती है।
निम्नलिखित तालिका केवल संदर्भ के लिए है।
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नमूना प्रजाति |
नमूना नाम |
आरएनए उपज |
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पशु ऊतक |
चूहे का जिगर |
30-45 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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माउस तिल्ली |
20-30 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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चूहे का फेफड़ा |
10-20 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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चूहे की किडनी |
20-30 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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चूहा दिल |
5-10 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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माउस थाइमस |
10-20 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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चूहे का दिमाग |
5-10 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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माउस अग्न्याशय |
5-15 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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चूहे की मांसपेशी |
2-4 कुरूप/10 मि.ग्रा |
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मूंग की पत्तियां |
15-20 कुरूप/100 मि.ग्रा |
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प्रकोष्ठों |
हेला |
8-15 ug/106 सेल |
केवल अनुसंधान उपयोग के लिए!
लोकप्रिय टैग: पशु ऊतक और सेल आरएनए निष्कर्षण किट, चीन पशु ऊतक और सेल आरएनए निष्कर्षण किट निर्माता, आपूर्तिकर्ता, कारखाने
