उत्पाद परिचय
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प्रोडक्ट का नाम |
बिल्ली। नहीं। |
विशेष. |
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2×इन-फ़्यूज़न क्लोनिंग मिक्स |
G3350-20T |
20 T |
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G3350-100T |
100 T |
उत्पाद विवरण/परिचय
2×इन-फ़्यूज़न क्लोनिंग मिक्स को किसी भी वेक्टर में डीएनए के एक या 2 ~ 3 एकाधिक टुकड़ों की तेज़, दिशात्मक क्लोनिंग के लिए डिज़ाइन किया गया है, विशेष रूप से एकल टुकड़े के लिए उपयुक्त। यह डीएनए अंशों (उदाहरण के लिए, पीसीआर-जनरेटेड इंसर्ट और लीनियराइज्ड वैक्टर) को उनके सिरों पर 15-बीपी ओवरलैप्स को पहचानकर कुशलतापूर्वक और सटीक रूप से फ़्यूज़ करता है। इन 15-बीपी ओवरलैप्स को वांछित अनुक्रमों के प्रवर्धन के लिए प्राइमरों को डिजाइन करके इंजीनियर किया जा सकता है।
प्रीमिक्स लिगेज सिस्टम पर निर्भर नहीं करता है, जो वेक्टर स्व-बंधाव की पृष्ठभूमि को काफी कम कर देता है, और इसे सम्मिलित टुकड़े में निहित प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइज साइट पर विचार करने की आवश्यकता नहीं होती है। वेक्टर में एकल खंड क्लोनिंग के लिए, प्राप्त सकारात्मक क्लोन का अनुपात 99% तक है। मिश्रण के साथ, डीएनए नमूना तैयार करने से लेकर प्लेट रूपांतरित कोशिकाओं तक सभी ऑपरेशन थर्मोस्टेट उपकरणों के बिना कुछ ही घंटों में पूरे किए जा सकते हैं।
भंडारण और शिपिंग की शर्तें
गीली बर्फ के साथ जहाज; -20 डिग्री पर स्टोर करें, 12 महीने के लिए वैध।
उत्पाद सामग्री
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अवयव |
G3350-20T |
G3350-100T |
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2×इन-फ़्यूज़न क्लोनिंग मिक्स |
100 μL |
5×100 μL |
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pUC19 (रैखिकीकृत, नियंत्रण वेक्टर, 5 एनजी/μL) |
10 μL |
10 μL |
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नियंत्रण सम्मिलित करें (10 एनजी/μL) |
10 μL |
10 μL |
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नियमावली |
कॉपी पर |
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Assay प्रोटोकॉल/प्रक्रियाएँ
बंधाव प्रतिक्रिया करें
1. एक ऑटोक्लेव्ड, 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, निम्नलिखित जोड़ें (सिफारिश करें 10-यूएल प्रतिक्रिया प्रणाली):
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अवयव |
आयतन |
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2×इन-फ़्यूज़न क्लोनिंग मिक्स |
5 μL |
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वेक्टर डीएनए |
X μL |
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डीएनए डालें |
Y μL |
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न्यूक्लियस-मुक्त पानी |
10 μL में जोड़ें |
2. सामग्री को ट्यूब के नीचे तक लाने के लिए धीरे-धीरे मिलाएं और संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें।
3. बर्फ-पानी के स्नान (बर्फ-पानी के मिश्रण) में 5 - 10 मिनट तक सेते रहें।
4. ट्यूब को बर्फ पर रखें और परिवर्तन प्रतिक्रिया करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें। या आप तैयार होने तक लिगेशन मिश्रण को -20 डिग्री पर स्टोर कर सकते हैं।
परिवर्तन प्रतिक्रिया निष्पादित करें
5. रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं (जैसे ई.कोली डीएच5, ई.कोली टॉप10, आदि) में उचित लिगेशन मिश्रण डालें और धीरे से टैप करके मिलाएं। ऊपर-नीचे पाइपिंग करके मिश्रण न करें। शेष लिगेशन मिश्रण को -20 डिग्री पर संग्रहित किया जा सकता है।
5. बर्फ पर 30 मिनट तक सेते रहें।
6. 42 डिग्री जल स्नान में ठीक 90 सेकंड तक सेते रहें। मिश्रण या हिलाएं नहीं.
7. 42 डिग्री स्नान से अपकेंद्रित्र ट्यूब निकालें और उन्हें 2-5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
8. 900 µL एसओसी या एलबी माध्यम जोड़ें। संदूषण से बचने के लिए स्टेराइल तकनीक का अभ्यास किया जाना चाहिए। शेकिंग इनक्यूबेटर में सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 225 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री पर हिलाएं।
9. प्रत्येक परिवर्तन अपकेंद्रित्र ट्यूब से अलग, लेबल वाली एलबी एगर प्लेटों पर उचित मात्रा फैलाएं। यदि वांछित हो, तो शेष परिवर्तन मिश्रण को 4 डिग्री पर संग्रहीत किया जा सकता है और अगले दिन चढ़ाया जा सकता है।
10. प्लेट को पलट दें और रात भर 37 डिग्री पर सेते रहें।
ट्रांसफ़ॉर्मेंट्स का विश्लेषण करें
11. कालोनियों का चयन करें और प्लास्मिड अलगाव, पीसीआर, या अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण करें।
टिप्पणी
1. वेक्टर डीएनए और सम्मिलित डीएनए को जेल से शुद्ध किया जाना चाहिए और इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा उनकी गुणवत्ता और एकाग्रता का विश्लेषण किया जाना चाहिए। यदि सांद्रता कम हो तो बंधाव प्रतिक्रिया में पानी छोड़ा जा सकता है।
2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 डिग्री.
3. यह अनुशंसा की जाती है कि वेक्टर और इंसर्ट का मोलर अनुपात 1:1~1:3 हो; जब 2-3 टुकड़े जुड़े होते हैं, तो प्रत्येक टुकड़े के बीच दाढ़ का अनुपात 1:1 होता है, और बंधाव प्रतिक्रिया प्रणाली को समान अनुपात में बढ़ाया जा सकता है।
4. यदि वेक्टर और इंसर्ट की कुल मात्रा 5 μL से अधिक है, तो आप लिगेशन सिस्टम को 20 μL तक स्केल कर सकते हैं।
5. बंधाव उत्पाद की मात्रा सक्षम कोशिकाओं की मात्रा के 1/10 से अधिक नहीं होनी चाहिए, अन्यथा परिवर्तन दक्षता काफी कम हो जाएगी। बंधाव उत्पाद और सक्षम कोशिकाओं की मात्रा को समान अनुपात में बढ़ाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, बंधाव प्रणाली का 20 μL सक्षम कोशिकाओं के 200 μL को बदल देता है)।
6. 2×यूनिवर्सल लिगेशन मिक्स को उपयोग के 5-10 मिनट के भीतर तक -20 डिग्री पर रखा जाना चाहिए और उपयोग के तुरंत बाद -20 डिग्री पर वापस आ जाना चाहिए। फ्रीज-पिघलना चक्र को कम करने के लिए इसे एलिकोट में फ्रीज करने की सिफारिश की जाती है।
7. यदि परिवर्तन के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग किया जाता है, तो वेक्टर डीएनए और सम्मिलित डीएनए को कॉलम विधि या इथेनॉल अवक्षेपण विधि द्वारा शुद्ध किया जाना चाहिए।
केवल अनुसंधान उपयोग के लिए!
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